回顾问过Jimmy的8个问题

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跟南医大的同学互动历程，从他的本科到硕士，我也从工作到博士了，很神奇，现在考虑吸纳他进入生信技能树VIP团队，下面是他整理的我们之间的互动，诸位觉得可以加入的，就点个好看表示支持，20个即可！

回顾问过Jimmy的8个问题，有点感慨。

一来，光阴似箭，一年多了，当初被疑问纠结着时的抓狂还是历历如新。

再者，现在回顾起来，前5个问题都是不知所问，甚至连自己要问什么都没说清楚。

真的很抱歉。

以下是按照时间先后，记录了我不同学习状态的8个问题。

其中得到的建议为Jimmy你给我的核心回复。

补充是我之后对问题的理解补充。

Q1: 关于果蝇参考基因组下载的请教

原始问题：

参考基因组里面不应该是是每条染色体都有一条序列记录, 然后加上unplace 和 unlocal序列的吗？为什么在NCBI里下载的fasta序列里同一条染色体会有多个>NC >NW..., 而ensembl 里需要单独把每条染色体下下来呢?

哪种得到的才是真正的参考序列?

第一个问题其实就是：我下载对了吗。到底哪个是我要下的呢？

得到的建议：

对人类来说，除了1~22，X,Y,M之外，还有一堆contig序列。算起来就有93条序列了。

我想，对果蝇来说也是如此吧，除了正常的染色体，其余的小序列也很正常，毕竟测序组装是不完美的。

如果对你后续研究没什么影响，就忽略掉。  —— Jimmy

补充：

NCBI 提供的参考基因组是 FASTA format of the genomic sequence(s) in the assembly.

所以打开一看全都是 NCBI RefSeq ID 对应的一条一条的fasta，如： NW_001846822

ensembl的是 chromosome level 的数据，所以看起来就是每条染色体只有长长的一条fasta。

所以下FTP前，不清楚数据内容先看 READ.ME ! 下载后再检查md5sum 。

另外，对于新人，如果对你后续研究没什么影响，就忽略掉. 这句话是真的很重要。减轻了不少前期入门的压力。

Q2: CCDS 和 GFF 中的外显子坐标存在差异吗？

原始问题：

LINC00115 这个基因，在GFF 注释文件和CCDS里起始终止坐标差异很大

现在回想这个问题真的很让人不知道如何回答。

当时问这个问题，的确是连CCDS是什么都没搞懂。

首先；作为long intergenic noncoding RNA，LINC00115是没有CDS的，在CCDS文件里也标记了 Withdrawn 。

其次；不同的注释来源是会存在差别的，所以才有了CCDS项目整合这么多注释来源里大家一致的、高质量的CDS区域：

The CCDS tries to identify annotations of protein-coding regions in the human and mouse genomes that are consensual across several groups/institutes.

Q3: MutSig 软件的参考组序列可以换成hg38版本的吗？

原始问题：

想用MutSigCV来找出显著的突变基因,  MutSigCV只提供hg18/19的版本文件下载。

有什么方法可以把38版本的基因组转成MutSig可用的形式呢？

当时要用mutsigCV找显著突变，但是突变数据是对应hg38版本的，mutsigCV只支持hg18/19。

得到的建议：

第一种是去下载hg19的maf，第二种是进行坐标转换。

补充：

最后是重新下了hg19版本的maf，而不用做坐标转换，因为TCGA刚好提供了两类版本的数据。

mutsig 除了需要ref genome外，还依赖其他文件，所以只换hg38版本的ref genome其实是不行的。

Q4: TCGA数据中肿瘤样本和正常样本数量一定是对等的吗？

得到的建议：

得到了很接地气的回答。

不需要浪费那么多钱把每个人的正常对照测一次!!

Q5: 关于MAF突变文件里基因的突变类型（数量的问题）

原始问题：

我查看了一些maf文件里的样本突变情况，发现不少样本只有一类突变类型，遂很疑惑：为什么一个样本里一个基因只有一种突变类型的记录。

得到建议：

一个样本在一个基因上最多只有一种突变类型的记录，这个结论应该是错的。

不过一个样本一个基因一般突变一个位点，也有极少数情况下会突变2个及以上的位点。

补充：

DNA变异检测完后经过过滤，基因突变并没有我之前想的那么多。

例如TCGA中突变负荷较高的膀胱癌平均只有302个外显子突变，而乳腺癌的情况大概是在100内，而且大部分癌症里突变类型最多的是Missense突变，所以看到“某个基因只有一种突变类型的记录” 也是正常的。

当然也有一个基因同时发生missense突变、nonsense突变、frameshit突变的情况，这种就归为 Multi-hit的了。

Q6-Q8: 关于GATK的问题

原始问题：

1. HaplotypeCaller这步时间非常久，一个样本耗时15～20hr，这个时间合理吗？

2. 用mutect2 call somatic时候，PoN是要用自己样本制作的还是可以用GATK提供的？

3. call variants的工具有很多，像bcftools，varscan2等，当初是认为GATK为金标准所以选了它，但现在发现它时间长且步骤繁琐，而其他工具就简单很多，所以还想问下经验：call variant 哪个工具是优选？ 得到建议 hc耗时久是正常的，然后pon是自己的，人类数据以gatk为准
补充： 

GATK时间的确很久，其中gemline variants calling里HaplotypeCaller 是耗时间大头，（somatic variants里用的mutect2也是）。但对GATK的时间优化也是可以发挥到极致的。 例如每年都会有天池风云挑战赛，选手竞相挑战最少时间跑完GATK（要求不超过30分钟），有靠GPU发力，有借助几百台云计算加持，有靠底层算法优化等等。当然是大量计算成本的投入换来的速度提升。商用的话可以考虑购买Sentieon DNASeq variant calling workflow。（非广告）

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回顾完这8个问题，突然想起一句话：The more you know, the more you know you don't know.

一开始以为做个blast相似性比对就是生物信息，后来发现有全基因组／转录组组转，有DNA variant Calling，CNV、HiC、3D chromosome。

也是如此，发现精力有限无法各个地方都深究，加之之前看到Jimmy为了探究肿瘤克隆进化做了做么多准备，所以我得学着，挑个有意义的方向，消耗热情吧。